Sofortige Beseitigung von Biofilmen (iCBiofilm): ein optischer Ansatz zur Neubewertung der Bildgebung von bakteriellen und pilzlichen Biofilmen

May 19, 2024

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 38 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Bildgebung des gesamten Biofilms mit Einzelzellauflösung ist für die Analyse der zellulären Heterogenität auf Systemebene, die Identifizierung wichtiger Matrixkomponentenfunktionen und die Reaktion auf Immunzellen und antimikrobielle Mittel erforderlich. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode zur Beseitigung und Bildgebung des gesamten Biofilms entwickelt, die als sofortige Beseitigung des Biofilms (iCBiofilm) bezeichnet wird. iCBiofilm ist eine einfache, schnelle und effiziente Methode, bei der Biofilmproben in ein Medium mit passendem Brechungsindex eingetaucht werden, was eine sofortige Abbildung des gesamten Biofilms mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie ermöglicht. Wir haben auch den nicht-fixierenden iCBiofilm entwickelt, der eine Live- und dynamische Bildgebung der Biofilmentwicklung und der Wirkung antimikrobieller Wirkstoffe ermöglicht. iCBiofilm eignet sich für die mehrfarbige Bildgebung fluoreszierender Proteine, immungefärbter Matrixkomponenten und fluoreszenzmarkierter Zellen in Biofilmen mit einer Dicke von mehreren hundert Mikrometern. iCBiofilm ist von bakteriellen bis hin zu Pilzbiofilmen skalierbar und kann zur Beobachtung von Biofilm-Neutrophilen-Wechselwirkungen verwendet werden. iCBiofilm stellt daher einen wichtigen Fortschritt für die Untersuchung der Dynamik und Funktionen von Biofilmen und die erneute Betrachtung der Bildung von bakteriellen und pilzlichen Biofilmen dar.

Bakterielle Biofilme sind hochorganisierte Bakteriengemeinschaften, die sich auf abiotischen oder biotischen Oberflächen und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen bilden. Bakterielle Biofilme auf den Oberflächen medizinischer Implantate und Körpergewebe können gegen antimikrobielle Wirkstoffe und Wirtsabwehrsysteme, einschließlich Phagozyten, Komplemente und antimikrobielle Peptide, resistent sein. Dieses Phänomen verursacht verschiedene chronische Infektionskrankheiten beim Menschen, wie z. B. katheterbedingte Blutkreislaufinfektionen, Harnwegsinfektionen und Endokarditis1,2,3. Die Bildung von Biofilmen im klinischen Umfeld führt daher zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität und stellt eine erhebliche finanzielle Belastung für das Gesundheitssystem dar. Darüber hinaus können Biofilme zu logistischen Problemen im technischen Betrieb führen, beispielsweise bei der Wartung von Trinkwasserverteilungssystemen4. Biofilme besitzen jedoch auch vorteilhafte Eigenschaften für die menschliche Industrie, wie sie beispielsweise bei der Produktion fermentierter Lebensmittel, bei Biokonversionsprozessen für organische Verbindungen und bei der Abwasserbehandlung genutzt werden5. Die Entwicklung innovativer Strategien zur Kontrolle und Analyse der Biofilmbildung ist daher für verschiedene Bereiche von Bedeutung.

Es wird angenommen, dass Bakterienzellen in Biofilmen von einer typischerweise selbst produzierten Matrix umgeben sind, die extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) wie Proteine, Polysaccharide und/oder extrazelluläre DNA6 umfasst. EPS spielt vielfältige Rollen bei der Bildung und Aufrechterhaltung von Biofilmstrukturen durch die Stimulierung der Mikroben-Mikroben-Kohäsion und der Mikroben-Oberflächen-Adhäsion6. Allerdings sind die dreidimensionalen Verteilungen der Biofilmmatrixkomponenten und die heterogenen Eigenschaften eingebetteter Bakterienzellen nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus ist Heterogenität oder Zelldifferenzierung in Biofilmen ein allgemein akzeptiertes Konzept, bei dicken Biofilmen war es jedoch schwierig, direkte Beweise auf mikroskopischer Ebene zu erhalten.

Die Entwicklung von Strategien, die eine schnelle und effiziente Visualisierung von Biofilmen ermöglichen, ist daher notwendig, um ihre Strukturen und Funktionen besser zu verstehen, einschließlich Interaktionen mit anderen Mikroben und dem Wirt sowie Reaktionen auf antimikrobielle Mittel. Optische Mikroskopie (OM) wie konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Lichtblattmikroskopie in Kombination mit Fluoreszenzsonden ermöglichten es Forschern hingegen, die dreidimensionale Biofilmarchitektur zu untersuchen und einen wesentlichen Beitrag zum aktuellen Verständnis von Biofilmen zu leisten7,8,9 ,10 bleibt die Abbildung dicker Biofilme auf Einzelzellebene eine Herausforderung, da das Eindringen von Licht in tiefere Regionen bei Verwendung herkömmlicher OM-Techniken begrenzt ist. Darüber hinaus ermöglichte Standard-CLSM mit einer Wasserimmersionslinse die Live-Bildgebung eines Vibrio cholera-Biofilms in Einzelzellauflösung11,12. Diese Methode kann auf die Bildgebung anderer bakterieller Biofilme anwendbar sein.

Bei der Gewebereinigung handelt es sich um einen Prozess, bei dem Biomakromoleküle (hauptsächlich Lipide) entfernt werden, was zu Lichtbrechung und -streuung führt und dadurch den Brechungsindex (RI) des Gewebes in einem umgebenden Lösungsmittel anpasst. Im Bereich der Neurowissenschaften ist die dreidimensionale Bildgebung auf der Grundlage der Gewebereinigung die praktischste Strategie zur Visualisierung einzelner Zellen in undurchsichtigen biologischen Proben, einschließlich ganzer Organe und Tierkörper13. Das Grundprinzip der Reinigung menschlichen Gewebes mithilfe organischer Lösungsmittel wurde vor fast 100 Jahren eingeführt14. Seitdem wurden verschiedene Methoden zur Gewebereinigung entwickelt, darunter (i) Methoden auf der Basis organischer Lösungsmittel wie BABB15, 3DISCO16 und iDISCO;17 (ii) Methoden auf der Basis hydrophiler Chemikalien wie SeeDB18, CUBIC19 und Scale;20 und ( iii) Methoden auf Hydrogelbasis, einschließlich CLARITY21, PACT22 und SWITCH23. Obwohl in den letzten 10 Jahren verschiedene Methoden zur Gewebereinigung verfügbar geworden sind, wurden sie unseres Wissens noch nicht auf die Analyse der Struktur, Funktion und Physiologie von Biofilmen angewendet. Darüber hinaus bleibt die auf der Gewebereinigung basierende Lebendzellbildgebung eine Herausforderung, da typische Reinigungsmethoden eine Probenfixierung und zeitaufwändige Reinigungs- und Entfärbungsverfahren erfordern, deren Durchführung mehrere Tage oder mehr als eine Woche in Anspruch nimmt.

In dieser Studie haben wir eine Methode zur „sofortigen Beseitigung von Biofilmen (iCBiofilm)“ unter Verwendung von RI-passenden Medien entwickelt, um dicke Biofilme, die von grampositiven und -negativen Bakterien sowie eukaryontischen Candida albicans gebildet werden, mit einer Einzelzellauflösung zu untersuchen. iCBiofilm ermöglicht die dynamische und Live-Bildgebung der Biofilmentwicklung und der Aktivität antimikrobieller Wirkstoffe. Mit dieser Methode demonstrieren wir heterogene Verteilungen von Biofilmmatrixkomponenten in S. aureus-Biofilmen und schlagen einen zugrunde liegenden Mechanismus vor, wie die räumlichen Verteilungen von Biofilmmatrixproteinen bestimmt werden. iCBiofilm eignet sich auch zur Abbildung von Biofilm-Neutrophilen-Interaktionen.

Von den verschiedenen kürzlich entwickelten Gewebereinigungsreagenzien hielten wir SeeDB2 für das am besten geeignete für die Visualisierung dicker Biofilme mit Einzelzellauflösung, da es sich um ein einfaches, auf Einweichen basierendes und morphologieerhaltendes Produkt mit hohen Konzentrationen an Iohexol24 handelt. Daher haben wir als vorläufiges Experiment SeeDB2 ausgewählt, um einen dicken Biofilm abzubilden, der vom Modellmikroorganismus Staphylococcus aureus gebildet wird. In dieser Studie verwendeten wir hauptsächlich S. aureus MR23, einen klinisch isolierten, Methicillin-resistenten Stamm, der in einem mit 1 % Glucose (BHIG) ergänzten Gehirn-Herz-Infusionsmedium einen dicken Biofilm bildet9,25,26. Wir verwendeten inverse Mikroskope, um die dreidimensionalen Strukturen von Biofilmen sichtbar zu machen, die sich auf der Oberfläche von 35-mm-Schalen mit Glasboden bildeten.

Der reife Biofilm von MR23 war in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) undurchsichtig, nach Behandlung mit SeeDB2 jedoch transparent (Abb. 1a). Invertiertes CLSM ergab, dass beim Einweichen in PBS aufgrund der hohen Lichtstreuung und sphärischen Aberrationen nur Zellen sichtbar waren, die sich in der Nähe des Bodens des Biofilms, innerhalb von 10 μm von der Glasoberfläche, befanden (Abb. 1b). Es ist zu beachten, dass oberhalb des sichtbaren Bereichs ein sanfter Übergang in Z-Richtung beobachtet wurde, was auf das Vorhandensein von Bakterienzellen, nicht aber auf das Fehlen von Zellen hinweist. Wenn Biofilme hingegen mit SeeDB2 behandelt und mit Thioflavin T (ThT) gefärbt wurden, das bakterielle RNA27 färbt, wurde der obere Bereich mit einer sichtbaren Dicke von etwa 40 μm teilweise sichtbar (Abb. 1b). Wir stellten jedoch fest, dass die Reinigungskapazität von SeeDB2 nicht ausreichte und dass durch wiederholten Reagenzienaustausch einige Zellen aus dem Biofilm entfernt wurden. Darüber hinaus wurde vermutet, dass Saponin (das in SeeDB2 enthaltene Detergens) die Biofilmstruktur zerstört, da Detergenzien im Allgemeinen die Biofilmstruktur beeinflussen können. Daher war es unser Ziel, eine für Biofilme optimierte optische Reinigungsmethode unter Verwendung eines reinigungsmittelfreien Reagenzes zu entwickeln.

a Fotos von MR23-Biofilmen auf einem mit einem Gittermuster bedruckten Papier als Hintergrund wurden mit ImageQuant zur Übertragung aufgenommen. In den unteren Feldern sind auch Diagrammprofile für die mit den angegebenen Gewebereinigungsreagenzien behandelten Biofilme dargestellt. Als Kontrolle diente der mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) behandelte Biofilm. Die grüne Linie im oberen Bild zeigt jeweils die entsprechende Position des Plotprofils im unteren Bereich an. b Typische Seitenansichten der mit Thioflavin T (ThT) gefärbten MR23-Biofilme. Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM880 mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer Airyscan-Superauflösungseinheit (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) wurde verwendet, um alle 0, 22 μm Z-Stapel der gefärbten Biofilme zu erfassen. c Optische Dichte vs. Iohexol-Konzentration für MR23-Biofilme. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei Messungen. d Typische Seitenansichten fixierter MR23-Biofilme, gefärbt mit FM1-43 und getränkt in den angegebenen Iohexol-Lösungen. Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop LSM880 mit ×63-Objektiv und der Airyscan-Superauflösungseinheit wurde verwendet, um alle 0,18 μm Z-Stapel der gefärbten Biofilme zu erfassen. X und Z stehen für Breite bzw. Dicke.

Während der Biofilm-Beseitigung mit SeeDB2 stellten wir fest, dass sich die Transparenz des S. aureus-Biofilms im Reinigungsschritt mit den Clearing-Lösungen 1 und 2 von undurchsichtig zu transparent änderte und dann in den Schritten mit den Clearing-Lösungen 3 und 4 wieder leicht undurchsichtig wurde Diese Beobachtung legt nahe, dass die RIs der Reinigungslösung 3 (RI = 1,46) und 4 (RI = 1,52) höher waren als die des S. aureus-Biofilms. Dementsprechend liegt der RI vieler Bakterien bei etwa 1,38–1,4228. Daher haben wir die Konzentration von Iohexol für den S. aureus-Biofilm optimiert, indem wir dessen Konzentration reduziert haben. Zu diesem Zweck haben wir eine Hochdurchsatz-Screening-Methode mit 96-Well-Kunststoffplatten und einem Mikrophotometer entwickelt, um die optischen Dichten von nicht fixierten S. aureus-Biofilmen zu messen, die in verschiedenen Konzentrationen von Iohexol getränkt sind. Die optische Dichte des Biofilms veränderte sich abhängig von der Iohexolkonzentration (Abb. 1c). Darüber hinaus beeinflusste die Fixierung mit 1 % Glutaraldehyd (GA) die chemischen Eigenschaften des Biofilms und erhöhte die für optimale Transparenz erforderliche Iohexolkonzentration (ergänzende Abbildung 1a). Wichtig ist, dass hohe Konzentrationen von Iohexol den Biofilm dispergierten, was zu einer Verringerung der Biomasse führte, wohingegen die Fixierung mit GA ihn stabilisierte (ergänzende Abbildung 1b). Daher wurden Biofilme in nachfolgenden Experimenten vor dem Einweichen in Iohexol fixiert. Nach diesem Verfahren wurde die niedrigste optische Dichte des GA-fixierten Biofilms mit 30–50 % (Gew./Gew.) Iohexol erreicht (ergänzende Abbildung 1a). Die CLSM-Bildgebung eines mit dem Membranfarbstoff FM1-43 gefärbten S. aureus-Biofilms ergab auch, dass Biofilme mit einer Dicke von> 60 μm in 35,2 % (Gew./Gew.) Iohexol deutlich sichtbar waren (Abb. 1d). In ähnlicher Weise wurde in allen Dicken mit Einzelzellauflösung deutlich ein ThT-gefärbter Biofilm beobachtet (Zusatzfilm 1). Am bemerkenswertesten ist, dass der undurchsichtige Biofilm unmittelbar nach der Zugabe von 35,2 % (w/w) Iohexol allein transparent wurde (Zusatzfilm 2), was darauf hindeutet, dass das RI-passende Medium ausreichte, um dem S. aureus-Biofilm Transparenz zu verleihen, ohne einige Biomoleküle zu entfernen. Diese einfache und effiziente Methode zur Visualisierung dicker Biofilme allein unter Verwendung eines waschmittelfreien, RI-passenden Reagenzes wurde als iCBiofilm bezeichnet. Bemerkenswert ist, dass das RI-passende Reagenz nicht auf Iohexol beschränkt ist (Ergänzende Abbildungen 2 und 3). Diatrizoat, Iodixanol, Iopromid, Iopamidol und Ioversol zeigten eine hohe Clearingkapazität (ergänzende Abbildung 2a). Diese Reagenzien verbesserten die Abbildung des dicken Biofilms im Vergleich zu PBS (ergänzende Abbildung 2b). Zuvor wurde eine Wasserimmersionslinse verwendet, um die Dynamik eines lebenden V. cholera-Biofilms zu analysieren11,12, wir konnten jedoch keine Unterschiede in der sichtbaren Dicke zwischen Öl- und Wasserimmersionslinsen beobachten, zumindest nicht im Fall der in PBS eingetauchten S . aureus-Biofilm (ergänzende Abbildung 2b). Daher glauben wir, dass die Anpassung des RI zwischen Biofilmen und der umgebenden Lösung für die Abbildung des gesamten Biofilms wichtiger ist als die Wahl einer Objektivlinse. Wie unten erwähnt, kann das RI-passende Reagenz zu Versuchszwecken geändert werden.

Als nächstes verglichen wir iCBiofilm mit anderen verfügbaren Gewebereinigungsmethoden, einschließlich CUBIC19, ScaleS29 und SeeDB224, zur Reinigung und Abbildung des MR23-Biofilms. Die Biofilm-Reinigungskapazität von iCBiofilm war denen der anderen überlegen (Abb. 1a). iCBiofilm verbesserte die Abbildung des MR23-Biofilms mit einer Dicke von ~80 μm erheblich, während die anderen Methoden für die Abbildung des gesamten Biofilms nicht ausreichten (Abb. 1b). Obwohl CUBIC, ScaleS und SeeDB2 mehrere Tage oder Wochen für die Entfernung von Biofilmen und Gewebe benötigten, benötigte iCBiofilm für die Entfernung von Biofilmen nur wenige Sekunden (Zusatzfilm 2). iCBiofilm bewahrte die Struktur des fixierten Biofilms, während SeeDB2 sie wahrscheinlich aufgrund des wiederholten Austauschs viskoser, mit Detergenzien ergänzter Reinigungsreagenzien beschädigte. Darüber hinaus war die Handhabung von iCBiofilm sehr einfach, während CUBIC, ScaleS und SeeD2 zwar einfach waren, aber viskose Reagenzien enthielten, was die Handhabung etwas erschwerte. Insgesamt war iCBiofilm die schnellste, einfachste, effektivste und nicht-invasive Methode zur Bildgebung des gesamten Biofilms (Tabelle 1).

Es wird angenommen, dass die Bildung eines bakteriellen Biofilms mit dem ersten Kontakt einer einzelnen Bakterienzelle mit einer Oberfläche beginnt, gefolgt von der Proliferation und Bildung einer Mikrokolonie, der Produktion extrazellulärer Matrizen, in die Bakterienzellen eingebettet sind, und der Bildung einer komplexen, dreidimensionalen Struktur bilden einen reifen Biofilm5. Um zu bestätigen, ob diese weithin akzeptierte Theorie mit unserer Methode beobachtet werden konnte, führten wir mit iCBiofilm eine Live-Cell-Bildgebung für die Biofilmentwicklung durch. Zunächst untersuchten wir die Zytotoxizität von Iohexol gegen S. aureus. Iohexol reduzierte die Trübung der Flüssigkultur, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von S. aureus (ergänzende Abbildung 4a, b).

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von Iohexol auf die Biofilmstruktur von S. aureus MR23. Bei der Kultivierung in BHIG bildete sich ein robuster Biofilm aus MR23, der fest an der Glasoberfläche haftete (ergänzende Abbildung 5). Bei der Kultivierung in BHIG, ergänzt mit 28,1 % (Gew./Gew.), Iohexol, wurde jedoch ein schwimmender, fragiler Biofilm beobachtet (ergänzende Abbildung 5). Dies deutete darauf hin, dass 28,1 % (Gew./Gew.) Iohexol die Wechselwirkung des Biofilms mit der Glasoberfläche beeinträchtigten und somit die Haftung und Struktur stark beeinträchtigten. Daher suchten wir nach RI-passenden Medien, die sich optimal für die Bildgebung fragiler Biofilme in lebenden Zellen eignen, wobei wir S. aureus MR4 als Indikatorstamm mit einem Biofilm verwendeten, der fragiler ist als der von S. aureus MR23. Alle getesteten Verbindungen erreichten eine Biofilm-Reinigung in ähnlichem Ausmaß (Abb. 2a), aber nur Iodixanol zeigte keine bemerkenswert zerstörerische Wirkung auf den vorgebildeten MR4-Biofilm (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass Iodixanol für verschiedene Arten von Biofilmen verwendet werden kann Biofilme. Wichtig ist, dass diese Verbindung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit, Wachstumsrate und Zellform von S. aureus hatte (ergänzende Abbildung 4b – d). Darüber hinaus war Iodixanol in der Lage, den Biofilm von S. epidermidis SE21 zu beseitigen, einem klinischen Isolat, das einen Polysaccharid-abhängigen Biofilm bildet (Abb. 2c) und keine Dispersion im vorgebildeten Biofilm verursachte (Abb. 2d). Auch die Wachstumsrate von S. epidermidis SE21 wurde durch Iodixanol nicht beeinflusst (Abb. 2e). Daher haben wir Iodixanol für die Lebendzellbildgebung der Biofilmentwicklung ausgewählt.

a Optische Dichte vs. Konzentration der angegebenen Brechungsindex-angepassten Medien für nicht fixierten S. aureus MR4-Biofilm. b Auswirkungen der Reinigungsreagenzien auf die Stabilität des nicht fixierten MR4-Biofilms. c Optische Dichte vs. Iodixanolkonzentration für nicht fixierten S. epidermidis SE21-Biofilm. d Auswirkungen von Iodixanol auf die Stabilität des nicht fixierten SE21-Biofilms. e Violindiagramme der Verdopplungszeiten von SE21-Zellen, gemessen durch optische Mikroskopie auf Einzelzellebene. Die Zellen wurden auf BHI-Agarplatten in Abwesenheit (BHI, n = 403) und Anwesenheit von 30,0 % (w/v) Iodixanol (BHI+, n = 283) unter dem Phasenkontrastmikroskop gezüchtet. ns, nicht signifikant (ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test). f Live-Cell-Clearing-Bildgebung zur Biofilmbildung von S. epidermidis SE21 in BHIG mit 30,0 % (w/v) Iodixanol und 25 μM ThT in einer Glasbodenschale. Es werden 3D-Bilder zu den angegebenen Zeitpunkten angezeigt. Pfeile zeigen Zellcluster an, die in der Anfangsphase der Biofilmbildung gebildet wurden. Mittelwerte und Standardabweichungen aus vier Messungen sind in a–d dargestellt.

Um mit dem konfokalen Mikroskop ZEISS LSM880 eine stabile Live-Cell-Bildgebung über die Zeit durchzuführen, wurden Biofilme 2–4 Stunden lang in einer Inkubationskammer auf einer konfokalen Mikrospore inkubiert, die mit einem Autofokus-Modul ausgestattet war. Zunächst wurde ThT zum Färben von S. epidermidis SE21-Zellen verwendet, da es das Wachstum bei einer optimierten Konzentration nicht hemmt27. ThT-gefärbte einzelne Zellen und Mikrokolonien konnten zu Beginn der Bildgebung leicht beobachtet werden (Abb. 2f und Zusatzfilm 3). Unerwarteterweise wurde im Laufe der Zeit zusätzlich zu den Mikrokolonien eine Proliferation von Zellen und nicht eine Expansion der Mikrokolonien beobachtet (Abb. 2f und Zusatzfilm 3). Dies war kein Nebeneffekt von ThT, da die konfokale Reflexionsmikroskopie eines nicht gefärbten S. epidermidis-Biofilms einen ähnlichen Trend zeigte (Zusatzfilm 4). Um die Anwendbarkeit der iCBiofilm-basierten Lebendzellbildgebung zu erweitern, haben wir auch MitoTracker Deep Red und das von Leica Microsystems entwickelte THUNDER Imaging System verwendet, um eine schnelle 3D-Lebendzellbildgebung durchzuführen. MitoTracker-Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zum Anfärben von Mitochondrien in eukaryotischen Zellen abhängig von ihrem Membranpotential verwendet und sind in der Lage, lebende Bakterien anzufärben, ohne die Wachstumsrate zu beeinträchtigen30. Aufgrund der hohen Bildgeschwindigkeit ermöglichte uns das THUNDER-Bildgebungssystem, die Ansammlung planktonischer Zellen auf der Glasoberfläche und auf dem bereits vorhandenen Biofilm zu beobachten (Zusatzfilm 5). Wie im Fall der LSM880-Bildgebung wurde im Laufe der Zeit überwiegend die Proliferation von an Mikrokolonien angrenzenden Zellen und nicht die Expansion bereits bestehender Mikrokolonien beobachtet (Zusatzfilm 5).

Zur Analyse der Biofilmbildung durch S. aureus MR23 wurde auch eine Lebendzellbildgebung mit iCBiofilm durchgeführt. Interessanterweise wurde eine Expansion von Mikrokolonien beobachtet, die mit der Ansammlung planktonischer und aggregierter Zellen über dem Biofilm einherging (Ergänzungsabbildung 6 und Ergänzungsfilm 6), was nicht mit dem oben beschriebenen Biofilmbildungsprozess von S. epidermidis SE21 übereinstimmte (Abb. 2f und ). Ergänzungsfilme 3–5). Es wurde ein leichter Rückgang der Fluoreszenz beobachtet, der wahrscheinlich auf eine Verringerung des Membranpotentials zurückzuführen ist, da die Stoffwechselaktivität innerhalb des Biofilms abnahm31. Darüber hinaus wurde die Biofilmbildung durch S. aureus MR4 durch iCBiofilm-basierte Lebendzellbildgebung sichtbar gemacht (Zusatzfilm 7), und der Prozess unterschied sich von dem von SE21 oder MR23 (Zusatzfilme 5 und 6). Insbesondere wurden hochdynamische und mobile Zellen während der Biofilmbildung durch MR4 beobachtet (Zusatzfilm 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Prozess der Biofilmentwicklung je nach Bakterienart und -stamm unterschiedlich ist. Die Lebendzellbildgebung mit iCBiofilm ist daher nützlich, um die Biofilmbildung über verschiedene Biofilmtypen hinweg zu analysieren.

Angesichts unserer Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass iCBiofilm eine Bildgebung lebender Zellen ermöglichen kann, wollten wir die Auswirkungen antimikrobieller Mittel auf einen lebenden Biofilm beobachten. Syto 9 und Propidiumiodid (PI) wurden verwendet, um zwischen lebenden und toten (membrangeschädigten) Zellen zu unterscheiden. Bei beiden handelt es sich um Nukleinsäurefarbstoffe, aber Syto 9 permeabilisiert sowohl lebende als auch tote Zellen, während PI nur membrangeschädigte (tote) Zellen permeabilisiert32. Diese Methode ermöglichte die stabile Visualisierung lebender und toter Zellen im Biofilm für mindestens 1 Stunde (Ergänzungsabbildung 7 und Ergänzungsfilm 8). Zuerst behandelten wir den Biofilm mit Vancomycin, das gegen Planktonzellen von S. aureus wirksam ist, jedoch nicht gegen seinen Biofilm32. Wie erwartet war Vancomycin bei der Abtötung von S. aureus-Zellen im Biofilm nicht wirksam (Ergänzungsabbildung 7 und Ergänzungsfilm 9). Als nächstes wurde aus Lactococcus lactis isoliertes Nisin A verwendet, da es als wirksam bei der Abtötung bereits gebildeter Biofilme verschiedener S. aureus-Stämme gilt32. Nach Zugabe von Nisin A stieg der Anteil toter Zellen schnell an, es wurden jedoch nicht alle Zellen abgetötet (Ergänzungsbild 7 und Ergänzungsfilm 10). Dies stimmte mit früheren CFU-Zähldaten überein, die zeigten, dass nur 90 % der Zellen im S. aureus MR23-Biofilm durch Nisin A32 abgetötet wurden. Interessanterweise zeigten Zellen in den konvexen Regionen des Biofilms im Vergleich zu Zellen in den konkaven Regionen eine Toleranz gegenüber Nisin A (Ergänzungsabbildung 7 und Ergänzungsfilm 10), möglicherweise aufgrund der heterogenen Verteilung anfälliger und toleranter Zellen und der Existenz von Matrixkomponenten Beeinträchtigung der Wirkung von Nisin A in den konvexen Regionen.

Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass iCBiofilm für die Abbildung der antimikrobiellen Wirkung auf Biofilme geeignet ist und für die Entwicklung medizinischer Lösungen zur Biofilmbeseitigung nützlich sein könnte.

Um zu testen, ob iCBiofilm zur Visualisierung von S. aureus-Matrixkomponenten eingesetzt werden kann, haben wir zunächst versucht, sekretierte und in der Zellwand verankerte Proteine ​​wie das extrazelluläre Adhärenzprotein (Eap) und das Staphylococcus aureus-Oberflächenprotein G (SasG) sichtbar zu machen. Wir verwendeten Anti-Eap-Antikörper und den spa-sbi-Doppel-Knockout-Stamm von MR23 (MR23 Δspa Δsbi), da Staphylokokkenprotein A (Spa) und das zweite Immunglobulin-bindende Protein (Sbi) die spezifische Immunerkennung von Zielproteinen hemmen (ergänzende Abbildung 8a). Wechselwirkung mit Immunglobulin G (IgG). MR23 Δspa Δsbi bildet einen robusten Biofilm, der dem des Wildtyp-Stammes entspricht, und Antikörper erreichten den Boden des Biofilms und zeigten erfolgreich die Lokalisierung von Eap in der gesamten Biofilmstruktur (Abb. 3a und Zusatzfilm 11). Eine beträchtliche Menge Eap war in der unteren Schicht des Biofilms lokalisiert und an der Oberfläche des Substrats befestigt. Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollexperimente keine Fluoreszenz in Abwesenheit eines Anti-Eap-Primärantikörpers (ergänzende Abbildung 8b) und auch nicht, wenn MR23 Δspa Δsbi Δeap anstelle von MR23 Δspa Δsbi (ergänzende Abbildung 8c) verwendet wurde, was darauf hinweist, dass Eap spezifisch nachgewiesen wurde durch den Antikörper. Darüber hinaus wurde Eap im oberen Bereich des Biofilms selten nachgewiesen (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass Eap eine Schlüsselrolle bei Zell-Substrat-Interaktionen spielt und nicht als Schutz auf der Oberfläche des Biofilms fungiert. Eine Nahaufnahme zeigte, dass Eap als Punkte oder kurze Fasern an den Grenzflächen zwischen S. aureus-Zellen nachgewiesen wurde (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass Eap als molekularer Klebstoff eine Rolle bei Zell-Zell-Interaktionen spielt. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen überein, dass Eap die Zellaggregation fördert25. Darüber hinaus unterschied sich die Verteilung von Eap von der des zellwandverankerten Proteins SasG, das ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Bildung dicker MR23-Biofilme spielt9. SasG lokalisierte sich auf der Oberfläche nur einer kleinen Anzahl von Zellen und bildete eine ringförmige Form. (Abb. 3c, d und Zusatzfilm 12). Die ringförmige Verteilung von SasG ähnelte der anderer zellwandverankerter Proteine, wie Spa34,35, Clumping Factor A, Fibronektin-bindendem Protein B und Serin-Aspartat-Repeat-enthaltendem Protein C36. Darüber hinaus bildeten SasG-exprimierende Zellen kleine Cluster (Abb. 3d und Zusatzfilm 12). Gemäß dem Zellwandverankerungsmechanismus von SasG sollte das oberflächenlokalisierte SasG von jeder Zelle, die es an der Oberfläche präsentiert, exprimiert und sezerniert werden37.

Die typischen Seitenansichten (a, c) und die XY-Schnitte für die ausgewählten Z-Stapelpositionen (b, d) von MR23 Δspa Δsbi-Biofilmen, gefärbt mit Antikörpern und FM1-43. Fluoreszenzsignale von Eap/SasG und Zellen (Membran) werden in der zusammengeführten Ansicht in Magenta bzw. Grün angezeigt. e Seitenansichten des von MR23 Δspa Δsbi Peap::mScarlet-1 gebildeten Biofilms. f XY-Schnitte für den ausgewählten Z-Stapel, die die Verteilung von Eap und Eap-exprimierenden Zellen im Biofilm zeigen. Fluoreszenzsignale von mScarlet-I (Eap-exprimierende Zellen), Anti-Eap/Alexa 488-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG und DNA (Gesamtbakterienzellen) sind in Magenta, Gelb bzw. Cyan in e, f dargestellt. g Die XY-Schnitte für den ausgewählten Z-Stapel zeigen die Verteilung von Zellen, die Eap und/oder SasG im 24-Stunden-Biofilm von MR23 Δspa Δsbi Peap::mScarlet-1 PsasG::mNeonGreen exprimieren. Fluoreszenzsignale von mScarlet-I (Eap-exprimierende Zellen), mNeonGreen (SasG-exprimierende Zellen) und DNA (gesamte Bakterienzellen) werden jeweils in Magenta, Gelb und Cyan angezeigt. Maßstabsbalken sind 5 μm. X und Z stehen für Breite bzw. Dicke. Alle Bilder wurden nach Einweichen der Biofilme in 35,2 % (w/w) Iohexol-Lösung aufgenommen. Ein LSM880-Mikroskop mit x20-, x63- und x100-Objektivlinsen und einer Airyscan-Superauflösungseinheit wurden verwendet, um Z-Stapel der gefärbten Biofilme zu erfassen.

Die nächste Frage, mit der wir uns befassten, war, warum Eap in den beobachteten Biofilmen solch charakteristische Verteilungsmuster aufwies. Ein mögliches Szenario bestand darin, dass die räumliche Verteilung der Eap-exprimierenden Zellen die Lokalisierung des Proteins bestimmte. Um dies zu untersuchen, generierten wir MR23 Δspa Δsbi, das die Transkriptionsfusion eap::mScarlet-1 exprimiert, aus dem Chromosom und untersuchten Zellen, die Eap exprimierten, mit iCBiofilm. Wie in Abb. 3e gezeigt, waren Eap-exprimierende (mScarlet-1-positive) Zellen in der unteren Hälfte des Biofilms lokalisiert. Sekretiertes Eap wurde in einer ähnlichen Region und auf der Oberfläche des Substrats nachgewiesen, wie in den ersten Eap-Experimenten oben beschrieben. Eap-exprimierende Zellen und sezerniertes Eap wurden im oberen Bereich des Biofilms selten beobachtet. Eine Nahaufnahme ergab, dass Eap-exprimierende Zellen heterogen verteilt waren und Cluster bildeten, in denen sekretiertes Eap überwiegend an der Grenzfläche zwischen Zellen lokalisiert war (Abb. 3f). Darüber hinaus war die Anzahl der SasG-exprimierenden Zellen geringer als die der Eap-exprimierenden Zellen und Subpopulationen von Eap-exprimierenden Zellen, die SasG koexprimierten (Abb. 3g).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass iCBiofilm für die mehrfarbige Bildgebung von Matrixproteinen und Bakterienzellen in Biofilmen mithilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper, fluoreszierender Proteine ​​und Nukleinsäuresonden verwendet werden kann.

Als nächstes verwendeten wir iCBiofilm, um extrazelluläre Polysaccharide und eDNA in einem S. aureus-Biofilm zu beobachten. Alexa Fluor 647-konjugiertes Weizenkeimagglutinin (WGA-Alexa 647) wurde zum Nachweis extrazellulärer Polysaccharide in einem S. aureus-Biofilm verwendet, da es stark an Poly-N-acetylglucosamine bindet, einen Hauptbestandteil der extrazellulären Polysaccharide von Staphylokokken25,26. Darüber hinaus wurde S. aureus MR10, ein klinisch isolierter Stamm des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus, ausgewählt, da er eine große Menge an Polysacchariden produziert und einen robusten Polysaccharid-abhängigen Biofilm bildet25,26. Wie in Abb. 4a, b dargestellt, bildete sich ein MR10-Biofilm mit einer Dicke von 25–50 µm und einer Oberflächenschicht aus Polysacchariden. Ein stark vergrößertes Bild zeigte Netzwerke extrazellulärer Polysaccharidfasern, die S. aureus-Zellen verbinden, was darauf hindeutet, dass sie als interzelluläre Adhäsine fungierten (Abb. 4c).

a–c Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bilder des S. aureus MR10-Biofilms, gefärbt mit WGA-Alexa 647 (PIA, Magenta) und FM1-43 (Zellen, grün). d–f CLSM-Bilder des S. aureus MR23 Δspa Δsbi-Biofilms, gefärbt mit monoklonalem Anti-dsDNA-Maus-Antikörper und Alexa 647-konjugiertem Anti-Maus-IgG (eDNA, Magenta) und FM1-43 (Zellen, grün). Der Biofilm wurde in 35,2 % (Gew./Gew.) Iohexollösung eingeweicht. Dargestellt sind die typischen Seitenansichten der Biofilme (a, d), orthogonale Bilder (b, e) und die XY-Schnitte für die ausgewählten Z-Stapelpositionen (c, f), die mit Objektiven ×20 und ×63 aufgenommen wurden. Die Maßstabsbalken sind 50 μm in b, e und 10 μm in c, f.

Darüber hinaus wurde eDNA mithilfe des monoklonalen Anti-dsDNA-Antikörpers nachgewiesen. Der Stamm MR23 Δspa Δsbi wurde verwendet, da ihm IgG-bindende Proteine ​​fehlen, die den spezifischen Nachweis von Proteinen mithilfe von Antikörpern beeinträchtigen33. eDNA wurde hauptsächlich im oberen Bereich des Biofilms nachgewiesen (Abb. 4d, e). Im Gegensatz zu den fibrillären Strukturen extrazellulärer Polysaccharide (Abb. 4c) wurde eDNA als Punkte und Aggregate auf Bakterienzelloberflächen nachgewiesen (Abb. 4f).

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass iCBiofilm nützlich ist, um die heterogene Verteilung mehrerer Biofilmmatrixkomponenten in dicken Biofilmen von S. aureus abzubilden und die Mechanismen zu analysieren, wie solche Muster bestimmt werden.

Es wird angenommen, dass Bakterienzellen in einem Biofilm vor Wirtsabwehrsystemen wie Neutrophilen und antimikrobiellen Peptiden geschützt sind1. Unser Ziel war es, dies mithilfe von iCBiofilm zu untersuchen. Hier wurde Ioversol anstelle von Iohexol verwendet, da Iohexol dazu neigte, nicht fixierte S. aureus-Biofilme zu zerstreuen (ergänzende Abbildung 1) und möglicherweise die Wechselwirkung zwischen Biofilmen und Neutrophilen auflöst. Wie in Abb. 5a, b und der ergänzenden Abb. 9a gezeigt, schienen Neutrophile über dem Biofilm zu schweben, was fälschlicherweise auf die Existenz nicht sichtbarer Matrixkomponenten an der Grenzfläche zwischen sichtbaren Neutrophilen und dem Biofilm schließen lässt. Die iCBiofilm-Bildgebung zeigte jedoch deutlich, dass Neutrophile in den dicken Biofilm eindrangen (Abb. 5c, d, ergänzende Abb. 9b) und die S. aureus-Zellen phagozytierten (Abb. 5c und ergänzende Abb. 9c), was im Widerspruch zu den Langzeitergebnissen steht. etablierte Annahme, dass in Biofilme eingebettete Zellen durch die Biofilmmatrix vor Neutrophilen-Phagozytose geschützt werden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige Zellen im Biofilm als Lockvögel fungieren können, indem sie Neutrophile von den anderen Biofilmzellen fernhalten. Diese Strategie könnte zum Überleben von Biofilmzellen beitragen, die auf phagozytierende Zellen treffen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass iCBiofilm nützlich sein könnte, um die Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und der Immunabwehr des Wirts zu untersuchen.

Biofilme von S. aureus MR23 und Neutrophilen von Mäusen wurden mit FM1-43 (grün) bzw. Alexa 647-konjugiertem Anti-Ly-6G (magenta) gefärbt. Neutrophile wurden ebenfalls mit FM1-43 gefärbt, können jedoch aufgrund ihrer Größe und Form von Bakterienzellen unterschieden werden. Große magentafarbene Formen stellen Neutrophile dar, während grüne Formen Biofilmzellen darstellen. Die Proben wurden in PBS (a, b) oder 37,1 % (Gew./Vol.) Ioversol (c, d) eingeweicht und unter Verwendung eines LSM880-Mikroskops mit einer x63-Objektivlinse und einer Airyscan-Superauflösungseinheit beobachtet. a, c Orthogonale Bilder. Maßstabsbalken sind 10 μm. b, d 3D-Bilder.

Um die Anwendbarkeit unserer Methode auf die Abbildung eines gramnegativen Biofilms zu erweitern, verwendeten wir iCBiofilm zur Beobachtung eines Escherichia coli-Biofilms mit dem Ziel, Curli-Proteine, extrazelluläre Amyloidfasern, die von solchen Enterobakterien produziert werden, zu identifizieren. Eine frühere Studie mit Fluoreszenz- und Rasterelektronenmikroskopie enthüllte die Mikroanatomie und Mikrophysiologie eines E. coli-Makrokolonie-Biofilms, der auf Agarplatten gebildet wurde, mit einer beispiellosen zellulären Auflösung38; Über wässrige E. coli-Biofilme ist jedoch wenig bekannt. In dieser Studie kultivierten wir E. coli BW25113 in YESCA bei 25 °C für 3–7 Tage und produzierten dadurch Curli-Proteine ​​(Abb. 6a) in einem robusten Biofilm an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (Abb. 6b, c)39, 40. Wie im Fall von S. aureus-Biofilmen war der E. coli-Biofilm undurchsichtig und wurde nach dem Einweichen in 35,2 % (Gew./Gew.) Iohexol transparent (Abb. 6c). Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Anti-Curli-Antikörpers zeigte die Verteilung von Curli-Proteinen im gesamten wässrigen Biofilm (Abb. 6d, e). Eine Nahaufnahme offenbarte das Vorhandensein fibrillärer Strukturen, die mit dem Anti-Curli-Antikörper gefärbt waren, und die Zellen waren von einem Netzwerk aus Curli-Fasern umgeben (Abb. 6f).

a Ein typisches Transmissionselektronenmikroskopbild von E. coli BW25113, gewachsen auf YESCA-Agarplatten. Das Bild zeigt Bakterienzellen, die von Curli-Amyloidfasern umgeben sind (schwarzer Pfeil). b Bild einer geneigten YESCA-Flüssigkultur zur Bildung eines E. coli-Biofilms an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. c E. coli-Biofilme, eingeweicht in PBS oder 35,2 % (w/w) Iohexol. d Typische Seitenansichten von E. coli-Biofilmen, gefärbt mit Anti-Curli-Kaninchen-IgG und Alexa 647-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Curli, Magenta) und FM1-43 (Zellen, grün). Der Biofilm wurde in 35,2 % (Gew./Gew.) Iohexollösung eingeweicht und unter Verwendung eines LSM800-Mikroskops mit x63- und x100-Objektivlinsen und einer Airyscan-Superauflösungseinheit beobachtet. e Orthogonale Bilder. f Ein typischer XY-Abschnitt für die ausgewählte Z-Stapelposition. Die Maßstabsbalken sind 500 nm in a, 10 μm in e und 5 μm in f.

In einer früheren Studie wurde festgestellt, dass sich Curli und Curli-exprimierende Zellen im äußeren Bereich von auf Agarplatten gebildeten Mikrokolonien ansiedeln, wohingegen die unteren Zonen dieser Biofilme langgestreckte Teilungszellen und ein dichtes Netz aus ineinander verschlungenen Flagellen aufweisen41. Diese heterogene Verteilung von Curli stimmte nicht mit den in dieser Studie dargestellten Beobachtungen überein (Abb. 6d, e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Eigenschaften von E. coli-Biofilmen und die Verteilung der Curli-Fasern von den Kulturbedingungen abhängen. Diese Unterschiede könnten die ausgeprägte Anfälligkeit von wässrigen Biofilmen und Mikrokolonien von Curli-produzierenden E. coli gegenüber Antibiofilmmitteln wie Catechin aus grünem Tee, Epigallocatechin-3-gallat (EGCG)39,41 und dem pflanzlichen Flavonoid Myricetin42,43 erklären. Beispielsweise förderte EGCG den Abbau des RNA-Polymerase-Sigma-Faktors S (RpoS), einem der Hauptregulatoren der Curli-Biosynthese, über den Abbau durch die ATP-abhängige Protease ClpXP in wässrigen Biofilmen39, hatte jedoch keinen Einfluss auf den zellulären RpoS-Spiegel in Mikrokolonien41 .

Um die Anwendbarkeit von iCBiofilm auf Pilzbiofilme zu testen, haben wir Candida albicans als einen der wichtigsten pathogenen Modellpilze ausgewählt, der beim Menschen biofilmassoziierte Infektionen verursacht. Allerdings ist die dreidimensionale Abbildung ganzer C. albicans-Biofilme mit einer Dicke von mehr als 100 µm konventionell eine Herausforderung44. Wie in Abb. 7a gezeigt, wurde bei der PBS-Kontrolle nur der untere Bereich des Biofilms beobachtet, während bei Verwendung von 56,2 % (Gew./Gew.) Iohexol der gesamte Biofilm beobachtet wurde. Darüber hinaus war 45,0 % (w/v) Iodixanol auch für die Visualisierung des C. albicans-Biofilms wirksam (Abb. 7a), was darauf hindeutet, dass RI-passende Medien ausreichen, um C. albicans-Biofilme transparent zu machen und eine tiefe Bildgebung zu ermöglichen.

a 3D-Bilder von C. albicans-Biofilmen, gefärbt mit FM1-43. Die gefärbten Biofilme wurden in den angegebenen Lösungen eingeweicht und unter Verwendung eines LSM880-Mikroskops mit einer 20-fachen Objektivlinse beobachtet. b Seitenansicht und Unteransicht von C. albicans-Biofilmen, gefärbt mit den angegebenen Farbstoffen. c Seitenansichten und Unteransichten von C. albicans-Biofilmen, die unter den im Douglas-Modell verwendeten Bedingungen gebildet wurden45. d Seitenansicht und Unteransicht von C. albicans-Biofilmen, die unter ähnlichen Bedingungen in a und b gezüchtet wurden, jedoch mit einer anfänglichen Anzahl von C. albicans-Zellen von 107 KBE/ml. Die Biofilme wurden mit Con A-Alexa 594 angefärbt, in 45,0 % (w/v) Iodixanol eingeweicht und mit dem LSM880-Mikroskop beobachtet.

Als nächstes wurde Iodixanol mit kommerziell erhältlichen Montagereagenzien verglichen. Iodixanol war den anderen Medien zur Visualisierung von C. albicans-Biofilmen mit einer Dicke von mehr als 500 μm überlegen (ergänzende Abbildung 10a). Darüber hinaus zerstörten einige Immersionsmedien wie Super Clear Mount, Immersion M, ProLong Diamond und SlowFade Diamond teilweise den Paraformaldehyd (PFA)-fixierten C. albicans-Biofilm (Ergänzung Abb. 10b) oder den S. aureus-Biofilm (Ergänzung). Abb. 10c). Basierend auf diesen Erkenntnissen empfehlen wir 15,0–45,0 % (w/v) Iodixanol oder 35,2–56,2 % (w/w) Iohexol für die Bildgebung von C. albicans- und S. aureus-Biofilmen.

Für die Färbung des dicken C. albicans-Biofilms wurde Alexa Fluor 594-konjugiertes Concanavalin A (Con A-Alexa 594) als geeigneter erachtet als FM1-43 und Calcofluor White (Abb. 7b). Insbesondere wird die Verwendung von Calcofluor White für zukünftige Studien nicht empfohlen, da es uns aufgrund der kurzen Anregungs- und Emissionswellenlängen nur die Visualisierung eines basalen Bereichs des Biofilms ermöglichte.

Unteransichten des Biofilms zeigten viele Pseudohyphen und Hyphen, aber nur eine kleine Anzahl hefeförmiger Zellen (Abb. 7b), ein Ergebnis, das nicht mit dem Douglass-Modell übereinstimmt. In diesem Modell wird vorgeschlagen, dass hefeförmige Zellen an das Substrat binden und eine basale Polyschicht bilden, die den Biofilm verankert. Darauf folgt das Auftreten von Keimschläuchen aus oberen Hefezellen, die Verlängerung der Hyphen und die Ablagerung einer extrazellulären Matrix, die aus Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden und Nukleinsäuren besteht45. Diese Diskrepanz könnte auf Unterschiede in den Kulturbedingungen zurückzuführen sein. Daher haben wir einen C. albicans-Biofilm nach dem Verfahren des Douglas-Modells hergestellt. Obwohl im Vergleich zum vorherigen Verfahren eine höhere Anzahl hefeförmiger Zellen am Boden des Biofilms beobachtet wurde, bildeten sie keine Polyschicht (Abb. 7c). Ein ähnliches Ergebnis wurde beobachtet, als die Anzahl der anfänglichen C. albicans-Zellen von 106 auf 107 KBE/ml anstieg (Abb. 7d). Wir glauben, dass unser iCBiofilm-Verfahren die Einschränkung der Laserpenetration in dicke Biofilme bei Verwendung herkömmlicher aufrechter CLSM erheblich verringert und die Abbildung von C. albicans-Biofilmen, insbesondere im unteren Bereich der 3D-Struktur, verbessert hat.

Darüber hinaus wurde die Biofilmbildung durch C. albicans durch Lebendzellbildgebung mit iCBiofilm und dem THUNDER-Bildgebungssystem sichtbar gemacht, da Iodixanol das Zellwachstum (Verlängerungsrate der Hyphen) und die Form von C. albicans nicht beeinflusste (Abb. 8a – c). In den ersten 3 Stunden wurde eine Basalschicht des Biofilms mit einer Dicke von etwa 20 μm und vielen fallenden Planktonzellen beobachtet (Abb. 8d und Zusatzfilm 13). Anschließend wurden die Keimung und Verlängerung der Hyphen 4 Stunden nach Beginn deutlich sichtbar gemacht (Abb. 8d und Zusatzfilm 13). Die Verlängerung der Hyphen setzte sich im Laufe der Zeit fort und nach 24 Stunden erreichte die Dicke des Biofilms etwa 200 μm (Zusatzfilm 13). Die Einzelzellanalyse für C. albicans-Zellen, die in einer Basalschicht vorhanden sind, zeigte erneut, dass sich viele hefeförmige Zellen an der Glasoberfläche anhefteten und mehrere Stunden nach der Inokulation Hyphen keimten und ausdehnten (ergänzende Abbildung 11a). Die Dehnungsraten echter Hyphen und Pseudohyphen waren ähnlich (ergänzende Abbildung 11b, c).

a Das Wachstum von C. albicans SC5314-Zellen auf RPMI-Agarplatten in Abwesenheit (RPMI) und Anwesenheit von 30,0 % (w/v) Iodixanol (RPMI+) wurde durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Farbige Pfeilspitzen weisen auf einzelne sich verlängernde Hyphen hin. b Violindiagramme der Dehnungsgeschwindigkeiten von Hyphen, analysiert anhand mikroskopischer Bilder, die alle 1 Minute aufgenommen wurden. RPMI, n = 235. RPMI+, n = 185. ns, nicht signifikant (ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test). c ASEM-Bilder von SC5314-Zellen, die in RPMI- und RPMI+-Flüssigkulturen gezüchtet wurden. d Der Biofilm von SC5314 wurde in RPMI-MOPS (pH 7,0) mit 24 % (w/v) Iodixanol und 1 μM MitoTracker Deep Red in einer Schale mit Glasboden gebildet. 3D-Bilder zu den angegebenen Zeitpunkten werden in einer Heatmap-Farbskala angezeigt, die die Dicke des Biofilms darstellt. Die Skalen betragen 10 μm in a, c.

Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die Entwicklung eines lebenden Biofilms mit einer Dicke von >100 μm mit einer Einzelzellauflösung visualisiert.

Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer optischen Reinigungsmethode zur Untersuchung von Biofilmen. Die daraus resultierende Methode, iCBiofilm, erweist sich als vielversprechendes Werkzeug für die Tiefenbildgebung verschiedener mikrobieller Biofilme in vitro. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Gewebereinigung (CUBIC, ScaleS und SeeDB2) ist iCBiofilm eine schnelle, einfache, kostengünstige und nicht-invasive Methode, da die Biofilme lediglich in RI-passenden Medien eingeweicht werden müssen (Abb. 1 und). Tabelle 1). iCBiofilm ermöglicht die Bildgebung mehrerer mikrobieller Biofilme (S. aureus, S. epidermidis und C. albicans) in lebenden Zellen, eine Leistung, die bei herkömmlicher Gewebereinigung bisher als schwierig galt.

Die endgültig angepassten iCBiofilm-Verfahren werden in der ergänzenden Abbildung 12 und im Unterabschnitt „Beseitigung fixierter Biofilme mit iCBiofilm“ in Methoden beschrieben. Für die Bildgebung von Biofilmen mit lebenden Zellen wird empfohlen, einer geeigneten Kulturbrühe Iodixanol in einer Konzentration von 15–30 % (w/v) hinzuzufügen. Die Biofilmbildung von Bakterien und Pilzen, die konstitutiv fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, kann im Laufe der Zeit abgebildet werden, ohne dass fluoreszierende Sonden angefärbt werden. Alternativ können ThT- und Mitotracker-Reagenzien für die Bildgebung lebender Zellen verwendet werden. Für die 3D-Biofilm-Bildgebung sollten Biofilme mit 4 % PFA oder 1 % GA und 4 % PFA fixiert und dann mit einer oder mehreren geeigneten Fluoreszenzsonden belastet werden. Die Wahl der Fixierungsreagenzien und Fluoreszenzsonden hängt von den Eigenschaften der interessierten Biofilme und experimentellen Zwecken ab. Undurchsichtige Biofilme können durch Zugabe eines der iCBiofilm-Regenten sofort entfernt und mit CLSM oder anderen optischen Mikroskopen abgebildet werden. Als erste Wahl wird 45 % (w/v) Iodixanol zur Entfernung fragiler Biofilme empfohlen, während 35,2 % (w/w) Iohexol für stabile Biofilme empfohlen wird. Wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt, kann Iohexol durch andere RI-passende Medien ersetzt werden, einschließlich Iodixanol, Ioversol, Iopamidol und Iopromid, aber Iohexol kann im Vergleich zu den anderen schneller entfernt werden. Diatrizoat wird zur Biofilmentfernung nicht empfohlen, da es den verfärbten S. aureus-Biofilm entfärbt. Wenn die Reinigung nicht ausreicht, wird empfohlen, die Konzentration der RI-passenden Medien für einzelne Biofilme zu optimieren.

Unser Ansatz weist jedoch einige Einschränkungen auf. Die in dieser Studie für die Bildgebung lebender Zellen verwendeten Iodixanolkonzentrationen lagen geringfügig unter der optimalen Konzentration für die Biofilmentfernung, da höhere Konzentrationen die Biofilmbildung der getesteten Mikroorganismen auf der Glasoberfläche hemmten. Um die höchste Bildqualität und optimale Bedingungen für die Biofilmbildung verschiedener Mikroorganismen zu erreichen, sollten daher in Zukunft alternative RI-passende Medien entwickelt werden. Da niedrigviskoses Iodixanol dem hochviskosen Iohexol für die Bildgebung der Biofilmentwicklung in lebenden Zellen überlegen war, glauben wir, dass die Viskosität von RI-passenden Medien ein entscheidender Punkt für das Screening alternativer RI-passender Medien ist.

Die iCBiofilm-Methode war auch für die Abbildung von Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und Wirtsabwehrsystemen nützlich. Wir konnten die Phagozytose von Biofilmzellen durch Neutrophile analysieren. Allerdings haben wir die Proben mit PFA fixiert; Daher handelte es sich bei den erhaltenen Bildern um Schnappschüsse der Phagozytose. Die Bildgebung der Biofilm-Phagozytose durch Neutrophile in lebenden Zellen ist von großem Interesse, bleibt jedoch eine Herausforderung, da noch keine Technik zur Herstellung vollständig aktiver Neutrophilen entwickelt wurde, die mit fluoreszierenden oder genetisch veränderten Sonden markiert sind, um fluoreszierende Proteine ​​stabil zu exprimieren. Darüber hinaus unterscheiden sich die günstigen Bedingungen für das Wachstum von Biofilmen von denen für Neutrophile. Wenn diese technischen Probleme gelöst sind, kann iCBiofilm zur Bildgebung von Biofilm-Neutrophilen-Wechselwirkungen in lebenden Zellen verwendet werden.

Darüber hinaus wurden alle hier abgebildeten Biofilme unter statischen In-vitro-Bedingungen gebildet. Zukünftige Experimente sollten sich auf die Bestimmung der Feinstrukturen von Biofilmen konzentrieren, die in vivo (z. B. Biofilme, die sich auf den Oberflächen von medizinischen Geräten und Geweben bilden) und unter semi-in-vivo-Bedingungen (unter Verwendung eines Durchflusszellensystems) sowie in natürlichen Umgebungen gebildet werden. Unsere Erkenntnisse können daher zur Weiterentwicklung der Biofilmforschung beitragen und als Instrument zur Identifizierung oder Qualifizierung von Antibiofilm-Ansätzen in klinischen und industriellen Umgebungen verwendet werden.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme S. aureus, S. epidermidis, E. coli und C. albicans sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. E. coli wurde in Lysogenie-Brühe (LB) (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl) (Kanto Chemical Co., Inc., Tokio, Japan) und YESCA (1 % Casaminosäuren, 0,1 % Hefeextrakt). S. aureus und S. epidermidis wurden in BHI-Medium (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) gezüchtet. Sofern nicht anders angegeben, wurden diese Bakterien bei 37 °C kultiviert. Bei Bedarf wurde das Medium mit 1 % Glucose zur Förderung der Biofilmbildung oder mit Antibiotika zur Selektion von Transformanten ergänzt.

C. albicans wurde auf einer Hefe-Pepton-Dextrose-Platte (YPD) (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Dextrose und 2 % Agar), RPMI 1640 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gezüchtet ), gepuffert mit MOPS (pH 7,0) (RPMI-MOPS) oder SLee-Medium [0,5 % NaCl (FUJIFILM Wako Chemicals, Tokio, Japan), 0,5 % Ammoniumsulfat (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,25 % dibasisches Kaliumphosphat (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), 0,13 % L-Leucin (Nacalai Tesque), 0,1 % L-Lysin (Kanto Chemical Co.), 0,05 % L-Alanin (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05 % L-Phenylalanin (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05 % L-Prolin (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,05 % L-Threonin (Kanto Chemical Co.), 0,02 % Magnesiumsulfat (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,01 % L-Methionin (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,007 % L-Ornithin (Nacalai Tesque), 0,007 % L-Arginin (FUJIFILM Wako Chemicals), 0,0001 % D-Biotin (Nacalai Tesque), 0,1 mM Zinksulfat (FUJIFILM Wako Chemicals) und 1,25 % Dextrose (FUJIFILM Wako Chemicals)].

Das SeeDB2-Testkit, das SCALEVIEW-S-Testkit, die deScale-Lösung und das CUBIC-Testkit wurden von FUJIFILM Wako Chemicals erworben. Das SeeDB2-Testkit enthielt SeeDB2G [56,2 % (w/w) Iohexol, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,267 mM EDTA]24, SeeDB2S [70,4 % (w/w) Iohexol, 10 mM Tris-HCl (pH). 7,6) und 0,267 mM EDTA]24, Saponin (Pulver) und sterilisierte Lösung von PBS (-). Das SCALVEIW-S-Testkit enthielt die Lösungen SCALEVIEW-S0, SCALEVIEW-S1, SCALEVIEW-S2, SCALEVIEW-S3, SCALEVIEW-S4 und SCALEVIEW-SMt. Das CUBIC Trail Kit enthielt die ScaleCUBIC-1-Lösung, die ScaleCUBIC-2-Lösung, die Montagelösung 1 und die Montagelösung 2. Iohexol [Omnipark 350; 56,2 % (w/w)] wurde von Daiichi Sankyo (Tokio, Japan) gekauft. Iodixanol [Optiprep; 60,0 % (w/v)] wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft. Ioversol [Optiray 350; 74,1 % (w/v)] wurde von Guerbet (Villepinte, Frankreich) gekauft. Iopromid [Iopromid 370; 76,9 % (w/v)], Iopamidol [Iopamidol 370; 75,6 % (w/v)] und Diatrizoat [Urografin 60 %; 47,2 % (w/v)] wurden von Fujifilm Wako Chemicals, Hikari Pharmaceutical Co. (Tokio, Japan) bzw. Bayel (Tokio, Japan) gekauft. Bei Bedarf wurden die Reagenzien mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) verdünnt.

Con A-Alexa 594, WGA-Alexa 647, NucBlue Fixed Cell ReadyProbe Reagent (DAPI), FilmTracer FM 1–43 Green Biofilm Cell Stain (FM1-43), MitoTracker Deep Red FM und das FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit waren gekauft von Thermo Fisher Scientific. Calcofluor White und ThT wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bzw. AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA) gekauft.

Der polyklonale Kaninchen-Anti-Eap-Antikörper wurde von Scrum (Tokio, Japan)25 entwickelt. Polyklonale Kaninchen-Anti-SasG-Antikörper9 und polyklonale Maus-Anti-SasG-Antikörper wurden von Eurofins Genomics (Tokio, Japan) entwickelt. Der Kaninchen-Anti-Curli-Antikörper wurde von Scrum (Tokio, Japan) entwickelt, und der monoklonale Maus-Anti-dsDNA-Antikörper wurde von Abcam (Cambridge, MA, USA) erworben33. Alexa 405-konjugiertes Anti-Maus-IgG, Alexa 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa 647-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa 647-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG wurden von Thermo Fisher Scientific erworben. Alexa Fluor 647-konjugierter Anti-Maus-Lymphozyten-Antigen-6-Komplex-Locus-G-Antikörper (Anti-Ly-6G-Alexa 647) wurde von BioLegend Japan, Inc. (Tokio, Japan) erworben.

Um die Eap-mScarlet-1-Transkriptionsfusion in S. aureus MR23 zu konstruieren, wurde ein DNA-Fragment mit dem 3'-Ende 500-bp-Fragment von MR23 eap, einer Ribosomenbindungsstelle, dem mScarlet-1-Gen mit seinem für S. aureus optimierten Codon konstruiert . aureus, und das 500-bp-Fragment der stromabwärts gelegenen Region von MR23 eap (eap-mScarlet-1) wurde von Eurofins (Tokio, Japan) erzeugt und in pEX-K4J2 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pEX-eap-mS1 genannt (Ergänzungstabelle 1). Die inserierte DNA wurde unter Verwendung von pEX-eap-mS1 als Matrize, KOD Plus Neo DNA-Polymerase (Toyobo, Osaka, Japan) und den Primern eap-mScarlet-pKOR1-F und eap-mScarlet-pKOR1-R (Ergänzungstabelle 2) amplifiziert ). Die amplifizierte DNA wurde mit dem QIAquick DNA Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt und unter Verwendung des BP Clonase Enzyme Mix (Life Technologies, Palo Alto, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers in pKOR146 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pKOR1-eap-mS1 genannt (Ergänzungstabelle 1).

Um die SasG-mNeonGreen-Transkriptionsfusion in S. aureus MR23 zu konstruieren, ein DNA-Fragment, das das 3'-Ende 500-bp-Fragment von MR23 sasG, eine Ribosomenbindungsstelle, das mNeonGreen-Gen mit seinem für S. aureus optimierten Codon und Das 500-bp-Fragment der Downstream-Region von MR23 sasG wurde von Eurofins (Tokio, Japan) erzeugt und in pEX-K4J2 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pEX-sasG-mNG genannt (Ergänzungstabelle 1). Die inserierte DNA wurde unter Verwendung von pEX-sasG-mNG als Matrize, KOD Plus Neo DNA-Polymerase (Toyobo, Osaka, Japan) und den Primern sasG-mNeon-pKOR1-F und sasG-mNeon-pKOR1-R (Ergänzungstabelle 2) amplifiziert ). Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung des BP Clonase Enzyme Mix gemäß den Anweisungen des Herstellers in pKOR146 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pKOR1-sasG-mNG genannt (Ergänzungstabelle 1).

Unter Verwendung von pKOR1-eap-mS1 und pKOR1-sasG-mNG wurde ein Allelaustausch durchgeführt9,33. Kurz gesagt, diese Plasmide wurden durch Elektroporation in S. aureus RN4220 transformiert. Die aus RN4220 gereinigten Plasmide wurden durch Elektroporation weiter in den Zielstamm MR23 Δspa Δsbi transformiert und die Gene mScarlet-1 und mNeonGreen wurden durch homologe Rekombination in das Genom eingefügt46. Die konstruierten Stämme wurden MR23 Δspa Δsbi eap-mS1, MR23 Δspa Δsbi sasG-mNG und MR23 Δspa Δsbi eap-mS1 sasG-mNG genannt (Ergänzungstabelle 1).

Die Biofilmbildung wurde in Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt9,33. Die S. aureus-Stämme MR4 und MR23 sowie der S. epidermidis-Stamm SE21 wurden 16–20 Stunden lang in BHI (2 ml) bei 37 °C gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:1000 in BHIG verdünnt und die Suspensionen (200 μl) wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in Polystyrol-Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, NY) kultiviert. Die resultierenden Biofilme wurden verwendet, um die Auswirkungen von Klärreagenzien auf die optische Dichte und Stabilität zu untersuchen.

Nach der oben beschriebenen Biofilmbildung in Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen wurden das Kulturmedium und die planktonischen Bakterienzellen entfernt und den Biofilmen Reinigungsreagenz (100 μl) in den angegebenen Konzentrationen (siehe „Biofilm-Reinigungsreagenzien“) oder PBS zugesetzt. Um die experimentelle Genauigkeit sicherzustellen, wurden pro Reagenz mindestens drei Vertiefungen verwendet. Anschließend wurden die optischen Dichten bei 595 nm und 492 nm mit einem Mikroplattenlesegerät Infinite F200 Pro (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Anschließend wurden die Klärreagenzien entfernt und die Biofilme einmal sorgfältig mit PBS (100 μl) gewaschen. Verbleibende Biofilme wurden 10 Minuten lang bei 25 °C mit 0,05 % Kristallviolett (FUJIFILM Wako Chemicals) (50–100 μl) gefärbt. Nach der Färbung wurde jeder Biofilm einmal mit 100 μl PBS gewaschen und seine Masse durch Messung der Absorption bei 595 nm mit dem Mikroplattenlesegerät Infinite F200 Pro quantifiziert.

Übernachtkulturen von S. aureus-Stämmen, die 16–20 Stunden lang in BHI bei 37 °C gezüchtet wurden, wurden 1:1000 in BHIG verdünnt und 24 Stunden lang bei 37 °C in Schalen mit Glasboden (35 mm Durchmesser; Matsunami Glass, Osaka) inkubiert , Japan). Um die Wirkung von Iohexol auf die Biofilmbildung zu testen, wurden S. aureus-Biofilme in BHIG mit 28,1 % (w/w) Iohexol bei 37 °C für 24 Stunden in einer Glasbodenschale gebildet. Biofilme wurden mit 1 % (Gew./Vol.) GA, 4 % PFA oder beidem in PBS für 30 Minuten bei 25 °C fixiert. Nach der Entfernung der Fixierlösungen wurden die Biofilme dreimal mit DDW gewaschen und die fixierten Biofilme mit Fluoreszenzsonden oder Antikörpern angefärbt.

Zur Fluoreszenzfärbung von S. aureus-Zellen wurden Biofilme mit 25 μM ThT oder 5 μg/ml FM1-43, das Bakterienmembranen färbt, mindestens 30 Minuten lang bei 25 °C gefärbt. Bei Bedarf wurden Biofilme mit DAPI gefärbt, das DNA in fixierten Zellen färbt. Zur Identifizierung extrazellulärer Polysaccharide wurden S. aureus-Biofilme mit WGA-Alexa 647 bei 25 °C für mehr als 3 Stunden oder bei 4 °C über Nacht gefärbt.

Für die Immunfluoreszenzfärbung wurde S. aureus MR23 Δspa Δsbi33 verwendet. Zusätzlich wurden die Ableitungen Δspa Δsbi Δeap, Δspa Δsbi eap-mS1, MR23 Δspa Δsbi sasG-mNG und Δspa Δsbi eap-mS1 sasG-mNG verwendet. PFA-fixierte S. aureus-Biofilme wurden in Blockierungspuffer [3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,05 % Triton X-100, PBS, pH 7,4] 30 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden die Biofilme mit Anti-Eap-Kaninchen-Antikörper oder Anti-SasG-Kaninchen-Antikörper (1:200 in Blockierungspuffer verdünnt) inkubiert. Nach 3-stündiger Inkubation bei 25 °C wurden die Biofilme dreimal mit Blockierungspuffer gewaschen und mit Alexa 647-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG oder Alexa 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:200 in Blockierungspuffer verdünnt) inkubiert. bzw. bei 4 °C über Nacht. Die Biofilme wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 1 % GA und 4 % PFA in PBS für 30 Minuten bei 25 °C fixiert. Biofilmzellen wurden dann mit 5 μg/ml FM1-43 mindestens 30 Minuten lang bei 25 °C oder über Nacht bei 4 °C gefärbt. Für den Nachweis von eDNA wurden nach dem gleichen Verfahren monoklonale Maus-Anti-dsDNA-Antikörper und Alexa 647-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet.

Übernachtkulturen von E. coli BW25113, die in LB bei 30 °C gezüchtet wurden, wurden 1:1000 in YESCA verdünnt und 5 Tage lang bei 25 °C in Schalen mit Glasboden (35 mm Durchmesser; Matsunami Glass) gezüchtet. Die Schalen wurden schräg gestellt, um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu bilden, die die Bildung von E. coli-Biofilmen begünstigt40. Die resultierenden Biofilme wurden 30 Minuten lang bei 25 °C in 4 % PFA in PBS fixiert. Nach dem Entfernen der Fixierlösung wurden die Biofilme dreimal mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang in Blockierungspuffer (3 % BSA, 0,05 % Triton X-100, PBS, pH 7,4) bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden die Biofilme mit Anti-Curli-Antikörper (1:100 in Blockierungspuffer verdünnt) 3 Stunden lang bei 25 °C inkubiert oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Nach dreimaligem Waschen mit Blockierungspuffer wurden die Biofilme über Nacht bei 4 °C mit Alexa 647-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:100 in Blockierungslösung verdünnt) weiter inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Biofilme und Antikörper mit 1 % GA und 4 % PFA in PBS bei 25 °C für 30 Minuten fixiert, dreimal mit PBS gewaschen und in PBS mit 10 μg/ml FM1-43 gelagert Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren.

C. albicans SC5314 wurde 3 Tage lang bei 25 °C auf YPD-Platten gezüchtet und dann in RPMI-MOPS suspendiert. Zwei-Milliliter-Proben mit etwa 106–107 KBE/ml C. albicans-Zellen wurden 48 Stunden lang bei 37 °C in 35-mm-Schalen mit Glasboden (Matsunami-Glas) gezüchtet. Mit geringfügigen Modifikationen wurde auch ein C. albicans-Biofilm nach dem Douglas-Modell48 gebildet. Kurz gesagt, Planktonzellen von C. albicans SC5314 wurden in 5 ml Lee-Medium in einem Reagenzglas bei 37 °C 48 Stunden lang unter Schütteln mit 150 U/min gezüchtet und dann in RPMI-MOPS auf 107 KBE/ml verdünnt. Die Planktonzellsuspension wurde in eine 35-mm-Glasbodenschale gegeben und 1,5 Stunden lang statisch bei 37 °C inkubiert, um die Haftung an der Glasoberfläche zu ermöglichen. Nach der Entfernung nicht anhaftender Zellen und dem Austausch des Mediums wurden die Zellen 1,5 Stunden lang bei 37 °C unter leichtem Schütteln (10° Ablenkung, 18 Zyklen/Min.) inkubiert. Die Schale wurde einmal mit 1 ml RPMI-MOPS gewaschen, um nicht anhaftende und schwach anhaftende Zellen zu entfernen. Die restlichen anhaftenden Zellen wurden 48 Stunden lang in 3 ml RPMI-MOPS bei 37 °C inkubiert, um einen dicken Biofilm zu bilden. Der resultierende Biofilm wurde mit PBS, das 1 % GA und 4 % PFA enthielt, 30 Minuten lang bei 25 °C fixiert, dreimal mit DDW gewaschen und entweder mit FM1-43 (5 μg/ml in PBS), Con A-Alexa 594, gefärbt (25 μg/ml in PBS) oder Calcofluor White (1 mg/ml) im Dunkeln bei 4 °C bis zur Verwendung.

Nach der Entfernung der Fluoreszenzfarbstoffe wurden die Biofilme in den angegebenen Reinigungsreagenzien, Montagelösungen oder PBS als Kontrolle eingeweicht und mit einem CLSM-Mikroskop sichtbar gemacht.

Biofilme wurden in BHIG bei 37 °C 24 Stunden lang in 35-mm-Glasbodenschalen gebildet und mit PBS mit 4 % PFA 30 Minuten lang bei 25 °C fixiert. Bei fragilen Biofilmen wird eine Fixierung mit 4 % PFA und 1 % GA empfohlen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Biofilme mit Fluoreszenzsonden (FM1-43, fluoreszenzmarkierte Antikörper, fluoreszenzmarkierte Lektine usw.) angefärbt. Die gefärbten Biofilme wurden in einem der in DDW gelösten RI-passenden Medien eingeweicht. Als erste Wahl wird 35,2 % (w/w) Iohexol zur Entfernung von Biofilmen empfohlen, da es auf ein breites Spektrum von Biofilmen anwendbar ist und eine sehr schnelle Entfernung ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass das RI-passende Medium flexibel geändert werden kann. Reicht die Klärung nicht aus, sollte die Konzentration für die zu analysierenden Biofilme optimiert werden. Darüber hinaus wird empfohlen, 45 % (w/v) Iodixanol anstelle von Iohexol zu verwenden, wenn fixierte Biofilme brüchig sind und durch Iohexol beschädigt werden. Abschließend wurden die Proben mit CLSM wie unten beschrieben abgebildet.

Das SeeDB2-Testkit (FUJIFILM Wako Chemicals) wurde zur Durchführung der Biofilmentfernung gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, der PFA-fixierte Biofilm von S. aureus MR23 wurde mit einer Permeabilisierungslösung bestehend aus PBS (pH 7,4) und 2 % (Gew./Vol.) Saponin bei 25 °C über Nacht permeabilisiert. Anschließend wurde der Biofilm durch 24-stündige Inkubation mit Klärlösung 1 [2 % (Gew./Vol.) Saponin, 1/3 SeeDB2G-Lösung und 2/3 DDW] bei 25 °C und Klärlösung 2 [2 % (Gew.)] gereinigt /v) Saponin, 1/2 SeeDB2G-Lösung und 1/2 DDW] bei 25 °C für 6 Stunden, Klärlösung 3 [2 % (w/v) Saponin und SeeDB2G-Lösung] bei 25 °C für 24 Stunden und dann Klärlösung 4 [2 % (Gew./Vol.) Saponin und SeeDB2S-Lösung, ergänzt mit 25 μM ThT] bei 25 °C für 24 Stunden. Abschließend wurde der Biofilm in SeeDB2S-Lösung, ergänzt mit 25 μM ThT, eingeweicht und mittels CLSM untersucht.

Die PFA-fixierten Biofilme von S. aureus MR23 wurden durch andere Methoden zur Gewebereinigung entfernt, wie in der Ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben.

C57BL/6 J-Mäuse (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japan) wurden an der Jikei University School of Medicine, Japan, unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gehalten.

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Jikei University School of Medicine, Japan, genehmigt und gemäß genehmigten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Sechs C57BL/6 J-Mäuse (männliche und weibliche Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen) wurden gemäß dem vom Tierpflegeausschuss genehmigten Protokoll der Einrichtung eingeschläfert, und Knochenmarkszellen wurden aus den Oberschenkelknochen entnommen. Zum Spülen der Oberschenkelknochen wurde PBS mit 0,1 % BSA verwendet. Knochenmarkszellen wurden durch Zentrifugation bei 1.500 U/min für 5 Minuten bei 4 °C pelletiert und in 1 ml ACK-Lysepuffer (Thermo Fisher Scientific) bei 25 °C für 2 Minuten suspendiert, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Nach Zugabe von 9 ml PBS mit 0,1 % BSA wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 1.500 U/min bei 4 °C pelletiert. Das resultierende Zentrifugat wurde in 6 ml PBS suspendiert und auf 4 ml Histopaque-1077 und 4 ml Histopaque-1119 (Sigma) geschichtet. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 25 °C und 700 × g ohne Beschleunigung oder Verzögerung zentrifugiert. Neutrophile wurden an der Grenzfläche zwischen Histopaque-1077 und Histopaque-1119 gesammelt und einmal mit PBS mit 0,1 % BSA gewaschen. Abschließend wurden die Neutrophilen in RPMI 1640-Medium suspendiert und die Zellzahl unter einem Mikroskop gezählt.

Die 24-Stunden-Biofilme von S. aureus MR23, die wie oben beschrieben in Glasbodenschalen gebildet wurden (siehe „Fluoreszenzfärbung von Biofilmen für CLSM“), wurden zweimal mit 1 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden sie 30 Minuten lang bei 37 °C in 5 % CO2 mit Maus-Neutrophilen (4 × 106 Zellen/ml) inkubiert und in 0,5 ml RPMI 1640-Medium suspendiert, das 10 % (v/v) hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) enthielt ; Nichirei Bioscience. Inc., Tokio, Japan) und 1 % (v/v) hitzeinaktiviertes Mäuseserum. Nach der Entfernung nicht gebundener Zellen und Medien wurden die Biofilme und Neutrophilen mit 4 % PFA 30 Minuten lang bei 37 °C fixiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Proben wurden mit 0,5 ml Anti-Ly-6G-Alexa 647 (1:500 verdünnt in PBS, enthaltend 2 % (v/v) hitzeinaktiviertes FBS und 0,05 % NaN3) bei 4 °C über Nacht im Dunkeln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Proben weiter mit FM1-43 in PBS bei 25 °C für mindestens 30 Minuten oder bei 4 °C über Nacht im Dunkeln gefärbt. Schließlich wurden die Biofilme und Neutrophilen in den angegebenen Lösungen eingeweicht und durch CLSM beobachtet, wie unten beschrieben.

Dreidimensionale Biofilmstrukturen wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops LSM880 (Carl Zeiss) mit Alpha-Plan-Apochromat ×100/1,46 Öl DIC M27 Elyra, Plan-Apochromat ×63/1,4 Öl DIC M27, Plan-Apochromat ×40/1,3 beobachtet Öl DIC UV-IR M27, C-Apochromat ×40/1,2 W Korr FCS M27, Plan-Apochromat ×20/0,8 M27e und Plan-Apochromat ×10/0,45 M27 Objektive. Die Bildaufnahme erfolgte bei 405 (für DAPI), 488 (für ThT, FM1-43 und Alexa 488), 561 (für Alexa 594) und 633 nm (für Alexa 647). Hochauflösende Bilder von Biofilmen wurden mit dem LSM880-Mikroskop mit einer Airyscan-Superauflösungseinheit (Carl Zeiss) aufgenommen. Die Bilder wurden mit einem x100-Objektiv mit digitalem Zoom x2, einem x63-Objektiv mit digitalem Zoom von x1,8 bis x5, x40-Objektiv mit digitalem Zoom von x1 bis x3 und einem x20-Objektiv aufgenommen mit digitalem Zoom von ×1 bis ×2, und Z-Schnitte wurden in Intervallen von 0,185 bis 2 μm aufgenommen.

S. epidermidis SE21 wurde über Nacht bei 37 °C in BHI (2 ml) kultiviert. Die Kultur wurde in BHIG auf 1:100 verdünnt und die Suspension in eine 35-mm-Schale mit Glasboden (Matsunami-Glas) gegossen. Nach 4-stündiger Vorinkubation bei 37 °C wurden das Medium und die Planktonzellen entfernt und die anhaftenden Zellen einmal mit BHIG gewaschen. Anschließend wurde der Schale BHIG (2 ml) mit 30,0 % (Gew./Vol.) Iodixanol und 25 μM ThT zugesetzt. Die Bildgebung lebender Zellen wurde mit dem konfokalen Rastermikroskop LSM880 mit einem Plan-Apochromat ×40/1,3-Öl-DIC-UV-IR-M27-Objektiv und einem Autofokusmodul durchgeführt. Während der Bildgebung wurde die Temperatur der Biofilm-Kulturschale mithilfe eines großen Käfiginkubators und eines Stufeninkubators auf 37 °C gehalten. Die 3D-Bilder wurden alle 30 Minuten aufgenommen und Z-Stapel wurden in Abständen von 1,216 μm aufgenommen. Als Kontrolle wurde eine Lebendzellbildgebung mit BHIG, ergänzt mit 25 μM ThT, jedoch ohne Iodixanol, durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Bildgebung lebender Zellen mit dem LSM880 im Reflexionsmodus durchgeführt. In diesem Fall wurde BHIG oder BHIG mit 30,0 % (Gew./Vol.) Iodixanol kein Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt und die Bilder wurden bei 633 nm aufgenommen.

Lebende Biofilme von S. aureus und C. albicans wurden mit dem THUNDER DMi8-Mikroskop abgebildet, wie in der Ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben.

Dreidimensionale Strukturen wurden mit der Mikroskopsoftware ZEN 3.0 SR black (64 Bit) für ZEISS-Mikroskopie (Carl Zeiss) und Imaris (Bitplane, Belfast, Vereinigtes Königreich) rekonstruiert. Für die Darstellung dreidimensionaler Bilder wurde der maximale Projektionsmodus zum Vergleich der Behandlungen verwendet (Abb. 1 und ergänzende Abb. 2). Die Dynamikbereiche der Bilder wurden mit der Min/Max-Funktion angepasst, die dabei helfen kann, den Anzeigebereich für jedes Bild zu automatisieren und zu optimieren. In den anderen Fällen wurde der transparente Modus zur Darstellung stereoskopischer Bilder verwendet, bei dem ein dreidimensionales Bild mit transparentem Effekt berechnet wurde.

Mit dem Leica THUNDER DMi8-Mikroskop aufgenommene Lebendzellbilder wurden mit dem THUNDER Imaging System (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) im SVCC-Modus verarbeitet.

ASEM-Bilder wurden mit dem ClairScope ASEM-System (JASM-6200, JEOL, Ltd, Tokio, Japan)33,49 aufgezeichnet, wie in der Ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Ver. durchgeführt. 9 für Windows-Betriebssystem (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Mithilfe des Student-t-Tests oder der einseitigen Varianzanalyse mit dem Post-Hoc-Test von Dunnett wurde ermittelt, ob Gruppen statistisch signifikante Unterschiede in der Wirkung von Immersionslösungen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben aufwiesen. Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Die Stichprobengrößen sind in den Legenden der Abbildungen und in den Zusatzdaten 1 angegeben. Für alle Analysen wurde P <0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Quelldaten, die den in den Abbildungen dargestellten Grafiken zugrunde liegen, sind in Supplementary Data 1 verfügbar oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Frau Naoko Toda für experimentelle Unterstützung, Dr. Koji Hayashizaki für die Präparation von Neutrophilen aus Mäusen, Dr. Ken-ichi Okuda für die Präparation von Nisin A, Dr. Mamiko Niki und Yukihiro Kaneko für Ratschläge zu C. albicans-Biofilmen, Dr. Jean-Marc Ghigo für eine kritische Durchsicht des Manuskripts und alle Mitglieder der Abteilung für Bakteriologie der Jikei-Universität für anregende Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (B) (Nr. 20H02904 an SS) und einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen (Post-Koch-Ökologie, Nr. 22H04889 an SS) unterstützt. von JSPS, JST ERATO (Nr. JPMJER1502 an SS) und dem Sumitomo Foundation Research Grant (an SS) sowie dem Jikei University Strategic Prioritizing Research Fund.

Abteilung für Bakteriologie, The Jikei University School of Medicine, 3-25-8 Nishi-Shimbashi, Minato-ku, Tokio, 105-8461, Japan

Shinya Sugimoto und Yuki Kinjo

Jikei Center for Biofilm Science and Technology, The Jikei University School of Medicine, 3-25-8 Nishi-Shimbashi, Minato-ku, Tokio, 105-8461, Japan

Shinya Sugimoto und Yuki Kinjo

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SS plante das Projekt, entwarf und führte die Experimente durch und analysierte die Daten. YK unterstützte alle Aspekte des Projekts. SS hat das Papier mit Unterstützung von YK verfasst

Korrespondenz mit Shinya Sugimoto.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Wendy Mok und Zhijuan Qiu.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sugimoto, S., Kinjo, Y. Instantaneous Clearing of Biofilm (iCBiofilm): ein optischer Ansatz zur Neubewertung der Bildgebung von bakteriellen und pilzlichen Biofilmen. Commun Biol 6, 38 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04396-4

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Eingegangen: 14. März 2022

Angenommen: 21. Dezember 2022

Veröffentlicht: 23. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04396-4

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